冰冻切片免疫荧光单标实验方法-上海郑核

一、实验器材及试剂

1、实验器材

名称 厂家 型号

冰冻切片机 Thermo Cryotome E

载玻片 江苏世泰实验器材有限公司 80312-3181

载玻片 Servicebio

微波炉 格兰仕微波炉电器有限公司 P70D20TL-P4

脱色摇床 Servicebio TSY-B

涡旋混合器 Servicebio MX-F

掌上离心机 Servicebio D1008E

移液枪 Dragon KE0003087/KA0056573

组化笔 Gene tech GT1001

冰箱 青岛海尔股份有限公司 BCD-192TGN

正置荧光显微镜 日本尼康 Nikon Eclipse C1

成像系统 日本尼康 Nikon DS-U3

2、主要实验试剂

试剂 厂家 货号 稀释比

OCT包埋剂 Sakura 4583

EDTA（PH8.0)抗原修复液 Servicebio G1206

EDTA(PH9.0)抗原修复液 Servicebio G1203

柠檬酸（PH6.0）抗原修复液 Servicebio G1202

BSA Servicebio G5001

4%多聚甲醛 Servicebio G1101

PBS缓冲液 Servicebio G0002

荧光一抗：

荧光二抗：

DAPI Servicebio G1012

抗荧光淬灭封片剂 Servicebio G1401

二、冰冻切片免疫荧光实验步骤

1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分,多聚甲醛固定10min，待多聚甲醛完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

2、抗原修复：组织切片置于盛满EDTA 抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。低火10min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。（修复液和修复强度根据组织来确定）

3、画圈血清封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），甩干PBS，滴加BSA，封闭30min。

4、加一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

5、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

6、DAPI复染细胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

7、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

8、镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光）

三、冰冻切片免疫荧光实验结果判读

DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光

郑核生物优势货源：麦克林全国授权经销商、TCI、阿拉丁、Abcam、CST、三鹰、索莱宝、SIGMA、alfa、ACROS、WAKO、岸田化学、等试剂；病理实验的专业助手，病理切片，HE染色，免疫组化，特殊染色，病理大切片专业的设备，有资质的人员为大家提供动物组织脱水，包埋，制片，染色等病理科研技术服务！多组织包埋、切片、he染色、全景扫描

病理分析、masson染色、免疫组化、WB

免疫荧光、RT-PCR、透射电镜、ELISA

扫描电镜、生化检测收费标准私信，真是实验结果，公司正规运营资质可验查，为病理实验提供有效保障。；优势产品：Roche、BD、santa、R&D、博士德、博奥森、联科、华美、南京建成、Thremo、Millipore、Axygen、NEST、四季青、gibco、百灵威、ELK、abways、BI、bioword、affinity、bioss、欣博盛、PAN、同仁、康为、汇力、天根等;